Sekuensing DNA - Tehnik Sanger

Loading...

Sekuensing DNA - Tehnik Sanger

Biologimu. Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA. Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.


Metode Sanger Memerlukan :
  • DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA
  • Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi
  • DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template
  • Sejumlah nukeotida normal 
  • Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)
  • Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).
  • Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti
  • Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel.
  • Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.
Tahapan Sekuensing Metode Sanger :

1. Tahapan sekuensing yang pertama adalah menyediakan dsDNA (double strand DNA)



2. Memotong dsDNA (double strand DNA) menjadi ssDNA (single strand DNA)



3. Mengambil template (cetakan) DNA dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA tadi



4. Menyediakan seluruh alat dan bahan untuk sekuensing DNA. Bahan untuk sekuensing adalah template (cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan enzym polymerase.



  • Template DNA berfungsi sebagai cetakan. 
  • Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang mengenal situs spesifik pada DNA template untuk memulai prooses polymerase. 
  • dNTP (deoksi nukleotida tri phospat) berfungsi sebagai sumber nukleotida pada proses polymerase sekuensing. dNTP ada 5 jenis, yaitu dATP (deoksi adenin tri phospat), dGTP (deoksi guanin tri phospat), dUTP (deoksi urasil tri phospat), dCTP (deoksi citosin tri phospat), dan dTTP (deoksi timin tri phospat).
  • ddNTP (dideoksi nukleotida tri phospat) berfungsi untuk menghentikan/terminasi proses enzim polymerase, sehingga proses perbanyakan nukleotida terhenti.
  • Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi polimerisasi atau perbanyakan nukleotida.
5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP, ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP, tabung kedua diisi dengan ddCTP, tabung ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung keempat diisi dengan ddTTP.



6. Setelah masing-masing tabung diisi dengan ddNTP, kemudian masing-masing tabung diisi dengan dNTP, sebagai sumber nukleotida pada proses polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan dTTP.



7. Memasukkan dNTP ke dalam tabung reaksi tadi.



8. Kemudian memasukkan primer ke dalam tabung reaksi. Primer berfungsi mengenali situs spesifik pada DNA template, juga berfungsi sebagai landasan/pijakan untuk memulai polimerisasi.




9. Setelah pemberian primer, juga dimasukkan enzim polimerase (taq-polymerase). Enzim polimerase memulai proses polimerisasi



10. Enzim polymerase terus mengkatalisis pembentukan polinukleotida dari nukleotida dNTP (deoksi nukleotida tri phospat)





11. Pada saat enzim taq-polymerase mengkatalisis pembentukan ikatan antara nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP) hadir berikatan dengan polimer nukleotida sebelumnya


13. Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida) mengakibatkan terhentinya/terminasi proses polimerase, sehingga dihasilkan rantai polinukleotida yang berbeda panjangnya



a). Berikut ini gambar perbedaan struktur dNTP (deoksinukleotida tri phospat) dan ddNTP (dideoksinukleotida tri phospat).



b). Keberadaan ddNTP menghalangi terbentuknya ikatan phospodiester antara satu nukleotida dengan nukleotida berikutnya, sehingga mengakibatkan terminasi/pengakhiran proses polimerisasi



13. Kehadiran ddNTP menghasilkan beberapa rantai polinukleotida berbeda

14. Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13 dilakukan pada semua tabung reaksi


15. Keempat tabung reaksi tersebut dipersiapkan untuk di alirkan pada gel agarosa



16. Perbedaan panjang polinukleotida tersebut, mengakibatkan perbedaan letak pada gel agarosa. Polinukleotida yang paling pendek bermigrasi/pergerakannya apling cepat pada gel agarosa.



17. Hasil pembacaan sekeuensing dari arah 5’ ke 3’ adalah rantai kompemen, yaitu 5’ AGCCGATCC 3’. Sehingga DNA templatenya adalah 5’ GGATCGGCT 3’



Daftar Pustaka
Balsover, S.R., J.S. Hyams, S. Jones, E.A. Shepard & H.A. White. 1997. From Genes to Cells. John Wiley & Sons. New York.

Buckingham, Lela dan Maribeth L. Flaws. 2015. Molecular Diagnostics. BSE
Campbell, Reece, Mitchel. 2002. Biologi Terjemahan edisi kelima jilid 1. Jakarta. Erlangga.

Triwibowo Yuwono. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta. Erlangga

Sumber Internet :

http://anshave.blogspot.com/2014/10/dna-sequencing.html

http://biotrends.blogspot.com/2015/01/mengenal-alat-analisa-molekuler-dna.html

http://id.wikipedia.org/wiki/Sekuensing_DNA

http://biologimu.com
Loading...

1 Response to "Sekuensing DNA - Tehnik Sanger"